Cromatografia

INTRODUÇÃO:
O termo cromatografia é atribuído ao botânico russo Mikhael Semenovich Tswett que, no início do século empregou a técnica para a separação de pigmentos presentes em folhas de plantas, através da passagem de extratos de folhas, arrastados por éter de petróleo, através de leitos de carbonato de cálcio finamente dividido. As espécies separadas (clorofilas e xantofilas) apareciam nos leitos como bandas coloridas, e por isso Tswett chamou o método de cromatografia, do grego chroma (cor) e graphein (escrever). A definição de cromatografia dada pela IUPAC em 1993 é a seguinte : cromatografia é o método físico de separação no qual os componentes a serem separados se distribuem entre duas fases, uma das quais estacionária, enquanto a outra se movimenta numa direção definida. A mistura que contém os componentes a serem separados é dissolvida na fase móvel. Durante a passagem da fase móvel através da fase estacionária, alguns componentes são fortemente retidos pela fase estacionária e por isso se movem lentamente com o fluxo da fase móvel enquanto isso, outros componentes interagem fracamente com a fase estacionária, sendo transportados mais facilmente pela fase móvel. Devido a essas diferenças em mobilidade, os componentes da mistura podem ser separados e analisados de forma qualitativa e/ou quantitativa, pela própria técnica de cromatografia ou em conjunto com outras técnicas experimentais, tais como a espectrofotometria ou a espectrometria de massas. Existem várias formas de realizar uma separação por meio de um processo cromatográfico. Diversas combinações são possíveis : a fase estacionária pode ser um sólido, um líquido imiscível à fase móvel ou um gel, fixado numa superfície plana ou dentro de uma coluna a fase móvel pode ser um líquido, um gás, ou um fluído supercrítico (um vapor pressurizado, em temperatura acima de sua temperatura crítica, que possui a vantagem de ter menor viscosidade que o líquido, mas mantendo as propriedades de interação com os solutos). Detalhes sobre algumas dessas formas são disponíveis nas referências apresentadas ao final do texto, ficando este texto restrito apenas á apresentação de aspectos mais gerais da técnica. Dentre os métodos modernos de análise química, a cromatografia é um dos mais empregados, encontrando aplicações nos mais variados ramos da pesquisa científica e tecnológica, devido à capacidade que possui de separar espécies químicas, de forma seletiva e específica.
CLASSIFICAÇÃO DOS MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS: Os métodos cromatográficos podem ser classificados de duas formas. A primeira, mais simples, é baseada na forma pela qual as duas fases são colocadas em contato. Segundo esse critério, os métodos poderiam ser classificados em duas categorias : é cromatografia em coluna, na qual a fase estacionária é mantida dentro de um tubo, em geral bastante estreito, dentro do qual a fase móvel é forçada por efeito de pressão ou pela efeito da gravidade é cromatografia planar, na qual a fase estacionária é suportada numa superfície plana ou nos interstícios de um papel. A fase móvel se move através da fase estacionária por efeito da capilaridade ou da gravidade. Outro critério de classificação, mais fundamental, é baseado nos tipos de fases estacionárias e móveis, e nos mecanismos envolvidos nas transferências de solutos entre as fases. A fase estacionária pode ser sólida ou líquida. No caso de fase estacionária líquida, o líquido pode simplesmente estar espalhado sobre um suporte sólido ou então estar imobilizado sobre este. Neste último caso, a fase líquida pode ser chamada de fase ligada. A fase móvel pode ser líquida, gasosa ou um fluído supercrítico. Os mecanismos que podem estar envolvidos em processos cromatográficos são mencionados na Figura 1, a seguir.
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Adsorção : processo baseado em interações eletrostáticas, dipolares (Van de Waals, por exemplo) ou pontes de hidrogênio, que ocorrem entre grupos ativos presentes na superfície da fase estacionária sólida e a fase móvel. Em processos cromatográficos, a adsorção é sempre reversível (a dessorção do soluto implica na volta deste à fase móvel). Partição : quando a fase estacionária é um líquido, espalhado na superfície de um suporte sólido e inerte ou nas paredes de um tubo, o processo é interfacial, ocorrendo por absorção, ou partição, que se baseia nas diferentes solubilidades dos componentes da amostra na fase estacionária. Troca Iônica : a fase estacionária é constituída de uma matriz onde são adicionados grupos funcionais ionizáveis (catiônicos ou aniônicos). A fase móvel é, geralmente, uma solução iônica com propriedades tamponantes, escolhidas de forma a ser compatível com o tipo de trocador usado. Bioafinidade : utiliza grupos funcionais, ligados quimicamente à matriz estacionária, que possuam especificidade biológica. Esses grupos retiram da fase móvel somente as suas espécies complementares, deixando passar todas as outras espécies. Exclusão : baseia-se em um processo puramente mecânico. A fase estacionária é uma matriz de composição inerte, com textura (superfície e distribuição de tamanhos de poros) controlada. Os componentes presentes na fase móvel podem ser separados porque os menores são capazes de penetrar facilmente em todos os poros da fase estacionária, equilibrando-se com a fase móvel que também entra nos poros, enquanto as maiores são excluídas, acompanhando a fase móvel que fica fora dos poros. As moléculas com tamanho intermediário entre esses dois extremos migram com velocidades variáveis, sendo que possuem penetração seletiva nos poros, entrando em alguns, mas não em todos. Figura 1 Representação esquemática dos mecanismos que podem estar envolvidos em processos cromatográficos Processos cromatográficos que utilizam fases estacionárias líquidas quimicamente ligadas a um suporte sólido também podem apresentar um mecanismo de separação que é um compromisso entre adsorção (sobre sítios ativos do suporte sólido) e partição (que ocorre na fase líquida quimicamente ligada). A contribuição relativa de cada mecanismo depende da quantidade relativa de cada tipo de grupo funcional existente. Uma classificação dos métodos cromatográficos, retirada de Collins et al. (1990), é apresentada na Tabela I 3 Tabela I Classificação dos métodos cromatográficos, retirada de Collins et al. (1990) TÉCNICA Fase Móvel Fase Estacionária líquida sólido ligada líquida sólido ligada sólido ligada líquida Tipo de Cromatografia CP CCD CCD CGL CGS CGFL CSS CSFL CLL CLS CE CLFL CTI CB Líquida PLANAR EM COLUNA Gasosa Fluido Supercrítico sólido ligada Líquida Sigla em Português Nome da Técnica Sigla em Português Nome da Técnica CP cromatografia em papel CSFL cromatografia supercrítica com fase ligada CCD cromatografia em camada delgada CLL cromatografia líquido-líquido CCD cromatografia em camada delgada CLS cromatografia líquido-sólido CGL cromatografia gás-líquido CE cromatografia por exclusão CGS cromatografia gás-sólido CLFL cromatografia líquida com fase ligada CGFL cromatografia gás-fase ligada CTI cromatografia por troca iônica CSS cromatografia supercrítica com fase estacionária sólida CB cromatografia por bioafinidade .
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PRINCÍPIOS BÁSICOS DA CROMATOGRAFIA Não será possível tratarmos de todos os métodos cromatográficos ao longo deste texto. Assim sendo, trataremos apenas de métodos de cromatografia em colunas. Normalmente, esse método procede com um fluxo contínuo da fase móvel, que permanece até que todos os componentes da mistura em análise tenham saído da coluna e tenham sido detectados. A Figura 2 mostra esquematicamente como duas substâncias A e B podem ser separadas numa coluna por eluição. A eluição envolve o transporte das espécies através da coluna pela adição contínua de fase móvel fresca (também chamada de gás ou líquido de arraste). No instante inicial da análise ( t t0 ), uma pequena quantidade da amostra, que pode inclusive estar diluída na fase móvel, é introduzida na coluna, em geral através de uma seringa manual ou de uma sistema de injeção automático, no menor intervalo de tempo possível. Conforme são transportados pela fase móvel, que entra de forma contínua na coluna, os componentes A e B da mistura vão se distribuindo ao longo das duas fases, e começa a se acentuar a separação entre os componentes ao longo das fases estacionária e móvel. Com o correr do tempo que implica na adição de maiores quantidades de fase móvel fresca o componente que interage mais fracamente com a fase estacionária vai sendo preferencialmente arrastado pela fase móvel. Isso ocorre porque a velocidade de arraste de um componente ao longo da coluna depende da fração de tempo que esse componente passa em cada fase : um componente que interage fracamente com a fase fixa, passa pouco tempo ligado à ela, permanecendo a maior parte do tempo na fase móvel. Idealmente, as diferenças entre velocidades de arraste leva à separação dos componentes da mistura em análise em bandas ou zonas da coluna. Com a continuação da passagem de fase móvel, as diferentes bandas vão se movendo ao longo da coluna, até atingir o seu final, onde são coletadas e/ou detectadas. Se um detetor que responde à presença dos compostos da mistura é colocado no final da coluna e o seu sinal ao longo do tempo é registrado em função do tempo (ou em função de uma outra variável significativa, como por exemplo o volume de fase móvel adicionado), uma curva apresentando uma série de pico, chamada cromatograma, é obtida. Uma curva desse tipo é mostrada na parte inferior da Figura 2. A curva pode ser utilizada tanto para obtenção de dados qualitativos e quantitativos : a posição dos picos ao longo do eixo do tempo pode servir para identificação qualitativa dos compostos da amostra, enquanto que as áreas sob os picos fornecem informações a respeito das quantidades relativas de cada um dos componentes da mistura. A Figura 3 mostra os dados que podem ser obtidos a partir de um cromatograma e seus respectivos símbolos. Figura 2 (a) Representação esquemática mostrando a separação de uma mistura de componentes A e B através de uma coluna cromatográfica, por eluição. (b) Curva do sinal de saída do detetor (cromatograma).
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FATORES ENVOLVIDOS NOS PROCESSOS CROMATOGRÁFICOS TERMOS DE RETENÇÃO Coeficiente de Distribuição ( K ) A eficiência da separação que pode ser conseguida numa coluna cromatográfica depende das velocidades com a quais as diversas espécies atravessam a coluna (em outras palavras, a velocidade com que cada espécie é eluída). Essas velocidades são determinadas pelas magnitudes das constantes de equilíbrio das reações que regem as distribuições das diversas espécies entre a fase móvel e a fase estacionária. Frequentemente, o tipo de equilíbrio envolvido em cromatografia pode ser descrito por equações simples, descrevendo o fenômeno de transferência de um soluto entre a fase móvel e a fase estacionária. Poderíamos escrever, para um composto A, a seguinte reação: A fase móvel ßà A fase estacionária A constante de equilíbrio K para essa reação é chamada de coeficiente de distribuição ou coeficiente de partição, e pode ser definido como K ( CE / CM ) (1) onde CE e CM representam as concentrações molares do composto A nas fase estacionária e móvel, respectivamente. Idealmente, o coeficiente de distribuição K é constante ao longo de uma larga gama de concentrações, e processos cromatográficos baseados nessa hipótese são chamados de processos cromatográficos lineares. Toda a discussão que será feita ao longo deste texto será limitada a esses processos. Tempo de Retenção ( tR ) e tempo de retenção corrigido ( tR ) O tempo de retenção é o tempo gasto por um componente desde a sua injeção na coluna até a sua detecção na saída do sistema. O tempo de retenção engloba todo o tempo que um componente fica no sistema cromatográfico, seja diluído na fase móvel, seja retido na fase estacionária. A Figura 3 ilustra um cromatograma típico, com a presença de um três componentes. O tempo indicado em primeiro lugar no cromatograma indica o tempo gasto pelas moléculas da fase móvel para atravessar a coluna e atingir o detetor: esse tempo é chamado de tempo morto (dead time, tM ), e normalmente é determinado por algum composto ou impureza presente na mistura em análise que não é retido pela fase estacionária. Quando tal composto não existe na mistura, é conveniente adicioná-lo, uma vez que é muito importante saber-se quanto tempo leva a fase móvel sem nenhum composto diluído para atravessar toda a coluna. No caso de cromatografia gasosa, esse tempo também pode ser determinado por alguma perturbação de pressão no sistema no momento da injeção, que aparece no cromatograma como uma perturbação na linha de base, de forma similar ao pico indicado na figura. Para a determinação dos tempos de retenção corrigidos (tR) é necessário conhecer o tempo morto, uma vez que a correção é feita simplesmente descontando o seu valor do valor do tempo de retenção. Relação entre Tempo de Retenção e Coeficiente de Distribuição As velocidades lineares de um soluto ( v ) e das moléculas da fase móvel ( u ) podem ser dadas, respectivamente, por : v ( L / tR ) (2) u ( L / tM ) (3) onde L é o comprimento da coluna cromatográfica.
INTRODUÇÃO AOS MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS: Assumindo que um soluto se move ao longo da coluna cromatográfica com a mesma velocidade da fase móvel quando nela está dissolvido, e que ele se encontra praticamente parado quando está retido na fase estacionária, poderíamos expressar a sua velocidade linear na coluna por v u x (fração do tempo que o soluto permanece na fase móvel). Essa fração, no entanto, pode ser igualada ao número de moles de soluto na fase móvel dividido pelo número total de moles do soluto que foi injetado na coluna. Dessa forma : v u x [ ( CM VM ) / ( CM VM + CE VE ) ] u x [ ( 1 / [ 1 + ( CE VE / CM VM ) ] (4) onde VM e VE são os volumes ocupados na coluna, respectivamente, pelas fases móvel e estacionária Substituindo a equação (1) na equação (4), chegamos a : v u x [ ( 1 / [ 1 + ( K VE / VM ) ] (5) Figura 3 Um cromatograma típico de uma mistura de três componentes, indicando os dados que podem ser obtidos e seus símbolos. Substituindo as equações (2) e (3) na equação (5), e chamando o termo ( K VE / VM ) de fator de capacidade k, chegamos a : ( L / tR ) ( L / tM ) x [ 1 / ( 1 + k ) ] (6) que, rearranjada, define a relação entre os tempos de retenção e o coeficiente de distribuição: k ( K VE / VM ) (tR tM) / tM (7) Para cada soluto, pode-se escrever a equação (7), e os valores obtidos serão específicos para cada par (soluto fase móvel). INTRODUÇÃO AOS MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS :
FATORES ENVOLVIDOS NOS PROCESSOS CROMATOGRÁFICOS TERMOS DE SEPARAÇÃO Os termos que acabaram de ser calculados, chamados termos de retenção, são característicos de cada soluto. Quando estão envolvidos mais um tipo de componente na amostra a ser analisada, também podem ser calculados os chamados termos de separação. Fator de Separação e Retenção Relativa O fator de separação ( ? ) é calculado pela razão entre os coeficientes de distribuição (K) de dois compostos que resultem em picos adjacentes no cromatograma, e pode ser relacionado também com os fatores de capacidade (k) e tempos de retenção : ? KB / KA kB / kA (tRB tM) / (tRA tM) (8) Um outro termo, a retenção relativa ( r L,p ) envolve a razão de tempos de retenção do componente e de um padrão, respectivamente. A retenção relativa é usada para identificação de substâncias e pode ser calculada para quaisquer picos no cromatograma, livre da restrição de serem adjacentes. Resolução Uma outra medida quantitativa de separação de dois componentes consecutivos num cromatograma é a resolução ( RS ), usada em cromatografia em coluna, e calculada a partir da distância que separa os máximos dos picos divididos pela média das larguras de suas respectivas bases, conforme apresentado na Figura 4. A resolução de uma coluna é uma medida quantitativa de sua habilidade em separar dois solutos, e é definida por : RS ( tRB tRA ) / [ ( WA / 2 ) + ( WB / 2 ) ] 2 ( tRB tRA ) / ( WA + WB ) (9) Figura 4 Separações em três resoluções diferentes
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EFICIÊNCIA DE UMA COLUNA CROMATOGRÁFICA Métodos para a estimativa da eficiência de uma coluna Dois termos, que estão relacionados entre si, são comumente usados para uma estimativa quantitativa da eficiência de uma coluna cromatográfica : são eles o número de pratos teóricos N e a altura equivalente a um prato H, que se relacionam pela equação (10) a seguir : N L / H (10) onde L é o comprimento da zona preenchida pela fase estacionária na coluna cromatográfica. Um prato teórico pode ser considerado uma etapa de equilíbrio no processo de distribuição de um componente dado entre as duas fases (móvel e estacionária), de forma análoga ao prato teórico de uma coluna de destilação. Quanto maior o número de pratos, mais etapas de equilíbrio existiriam e, dessa forma, melhor seria a separação entre compostos no processo cromatográfico. Duas equações podem ser utilizadas para estimar N, e nenhuma delas terá seu desenvolvimento detalhado neste texto (maiores informações podem ser obtidas nas referências mencionadas na literatura comentada). Ambas utilizam informações retiradas do cromatograma experimental, que podem ser vistas nas Figuras 3 e 4 : a primeira equação (11), utiliza o tempo de retenção tR e a largura na base W a segunda equação (12), considerada por alguns autores como mais confiável que a anterior, utiliza não mais a largura do pico na sua base, mas na sua meia altura, Wh. N 16 ( tR / W ) 2 (11) N 5,545 ( tR / Wh) 2 (12) A estimativa de H pode ser feita substituindo-se o valor de N calculado na equação (10), uma vez que o comprimento L normalmente é conhecido. Se no cálculo, no lugar do tempo de retenção tR for usado o tempo de retenção corrigido tR, o número de pratos é chamado de número de pratos efetivo. O número de pratos teóricos e a altura equivalente a um prato são largamente empregados na literatura e por fabricantes de equipamentos para avaliar o desempenho de colunas. No entanto, para que esses números tenham algum significado na comparação de duas colunas, é fundamental que eles tenham sido determinados nas colunas em comparação nas mesmas condições de ensaio e, principalmente, que tenham sido determinados para o mesmo componente. No entanto, apesar de serem frequentemente utilizados, deve-se atentar para o fato de que o uso desses dois termos pode induzir a um erro: de fato, numa coluna cromatográfica, jamais são atingidas condições de equilíbrio, uma vez que durante a operação uma das fases está em movimentação constante. Efeito da vazão da fase móvel na eficiência de uma coluna A eficiência na separação que pode ser alcançada numa coluna depende, dentre outros fatores, do tempo médio de contato entre as fases móvel e estacionária. Esse tempo, por sua vez, depende da vazão da fase móvel e do diâmetro da coluna (que, juntos, determinam a velocidade de escoamento da fase móvel ao longo da coluna). Ora, a vazão da fase móvel é um parâmetro facilmente ajustável, e por isso torna-se interessante observar como varia a eficiência de uma coluna com essa vazão. Esse estudo é feito normalmente através da determinação de H ( com o uso das equações (10) a (12) ) para diversos valores de vazão ou de velocidade de escoamento. Dados típicos de estudos desse tipo são apresentados nos gráficos da Figura 5. Ambos apresentam mínimos para H, que correspondem a valores máximos de eficiência, para baixos valores de vazão ou velocidade de escoamento da fase móvel. Como podemos ver na figura, os valores de mínimos para cromatografia líquida e gasosa são bem diferentes, sendo que a velocidade correspondente a um valor de H mínimo para cromatografia em fase líquida é significativamente menor do que no caso da cromatografia gasosa. No entanto, essa vantagem da cromatografia líquida acaba não se tornando uma vantagem prática porque raramente é viável o emprego .
INTRODUÇÃO AOS MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS : de colunas muito longas em cromatografia líquida (o mais comum é terem entre 25 cm e 1m), devido à queda de pressão ao longo da coluna com o escoamento do líquido (a chamada perda de carga). Já no caso da cromatografia gasosa, é muito comum serem utilizadas colunas de 50m ou mais de comprimento. Dessa forma, o número total de pratos teóricos e, consequentemente, a eficiência é frequentemente maior em cromatografia gasosa que em cromatografia líquida.
OTIMIZAÇÃO DO DESEMPENHO DE UMA COLUNA A estratégia a ser empregada para se conseguir realizar com sucesso a identificação de compostos presentes numa mistura por meio de uma separação cromatográfica pode ser exemplificada pelas seguintes etapas : (a) Seleção do método cromatográfico a ser empregado. Figura 5 Efeito da velocidade de escoamento da fase móvel na altura de um prato teórico para cromatografia líquida e gasosa. (b) Seleção do método cromatográfico a ser empregado. (c) Seleção ou preparação da coluna adequada ao método e à mistura a ser separada (determinação do diâmetro da coluna e escolha da fase estacionária). (d) Seleção das condições operacionais para um teste preliminar (escolha da fase móvel, da sua vazão, da temperatura, etc.). (e) Realização de um teste preliminar. (f) Avaliação do teste preliminar e estudo das mudanças a serem feitas (caso necessárias) para se atingir a resolução desejada com um tempo de ensaio mínimo. (g) Estabelecimento das novas condições de ensaio (se necessárias) para a obtenção da resolução desejada no tempo de ensaio desejado. (h) Se não forem atingidos os objetivos, avaliar a possibilidade de trocar a técnica escolhida inicialmente, ou então de empregar condições especiais de análise. Vamos a seguir desenvolver uma série de equações que serão extremamente úteis como guias para escolha de condições operacionais que podem permitir que sejam atingidos os principais objetivos de uma análise por cromatografia : uma separação clara de compostos, com um ensaio que dure o mínimo de tempo possível. Efeito dos fatores de capacidade (k) e de seletividade (a) na resolução Quando dois compostos se movem através de uma coluna de forma muito semelhante, no cromatograma eles poderão ser representados por picos muito próximos, podendo inclusive se confundir, como já foi visto na Figura 4. Uma coluna eficiente é aquela capaz de separar esses compostos, ou seja, aquela capaz de resolver esses picos. Vamos agora apresentar as equações que relacionam a resolução com as constantes de equilíbrio das reações que regem as distribuições das espécies entre a fase móvel e a fase estacionária, representadas pelos fatores de capacidade e seletividade.
INTRODUÇÃO AOS MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS: Para o desenvolvimento dessas equações, assumimos que estamos lidando com compostos A e B que apresentam tempos de retenção tão próximos que podemos assumir que WA WB ? W. A equação (9) torna-se então : RS 2 ( tRB tRA ) / ( 2W ) ( tRB tRA ) / W (13) Da equação (11) podemos tirar uma relação entre W, tR e N. Se aplicarmos essa relação para o composto B, e a substituirmos na equação (13), chegamos à equação (14), que pode ser rearranjada em termos dos fatores de capacidade ( usando a equação (7) ), resultando na equação (15) : RS [ ( tRB tRA ) / tRB ] x ( ?N / 4 ) (14) RS [ ( kA kB ) / ( 1 + kB )] x ( ?N / 4 ) (15) A equação (15) ainda pode ser rearranjada de modo a que se possa exprimir a resolução em termos do fator de seletividade ?, se usarmos a equação (8) : RS ( ?N / 4 ) x [ ( ? 1 ) / ? ] x [ ( kB / ( 1 + kB )] (16) Também é interessante obter uma equação que relacione o número de pratos teóricos necessário para se conseguir uma determinada resolução. Isso pode simplesmente ser feito através de um rearranjo da equação (16), resultando : N 16 RS [ ? / ( ? 1 ) ]2 x [ ( 1 + kB ) / kB ]2 (17) Efeito da resolução no tempo de retenção Um dos objetivos de uma análise cromatográfica é conseguir uma separação clara dos compostos da mistura analisada (ou seja, uma boa resolução) no mínimo de tempo possível (ou seja, com tempos de retenção os menores possíveis). É interessante, portanto, chegar a uma equação que relacione o tempo de retenção e a resolução, de forma a podermos avaliar quais os efeitos das variações de condições de operação em ambos. O tempo de duração de uma análise é dado pela tempo de retenção do componente que se move mais lentamente ao longo da coluna. Chamando esse componente de B, podemos escrever a sua velocidade linear através da equação (2). Combinando essa equação com as equações (5) e (10), podemos chegar à expressão : tRB [ N H ( 1 + kB ) ] / u (18) A equação (18) pode ser combinada com a equação (17), resultando na equação a seguir, que relaciona o tempo de retenção com a resolução : tRB ( 16 RS2 H / u ) x [ ? / ( ? 1 ) ]2 x [ ( 1 + kB )3 / ( kB )2 ] (19) Otimização do Desempenho Considerações Gerais As equações (16) e (19) podem servir de guias para a escolha das condições operacionais que devem ser empregadas para que os objetivos de uma boa análise sejam atingidos : uma separação nítida com o mínimo de tempo de análise. As duas equações são compostas por três termos: (a) o primeiro termo é relacionado com efeitos cinéticos que podem levar ao alargamento dos picos no cromatograma ( ?N ou H/u ) (b) o segundo termo está relacionado com a termodinâmica dos constituintes a serem separados, e é um termo de seletividade que só depende das propriedades dos compostos analisados (c) o terceiro termo também está relacionado com a termodinâmica dos constituintes, e é um termo de seletividade que depende das propriedades tanto dos compostos analisados quanto da coluna. Na busca pelas condições operacionais otimizadas, deve-se sempre ter em mente que alguns parâmetros fundamentais ( ?, k e N ou H ) podem ser ajustados de forma mais ou menos independente. Essa será a discussão feita a seguir, e o efeito das alterações desses parâmetros na resolução.
INTRODUÇÃO AOS MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS : Otimização do Desempenho Variação em N ou em H Uma forma evidente de aumentar a resolução de uma coluna é aumentar o número de pratos teóricos. Se isso for feito simplesmente pelo aumento do comprimento da coluna, normalmente o tempo de ensaio aumenta muito. É, portanto, muito mais interessante tentar alterar condições de operação que levem a uma diminuição da altura equivalente a um prato : H pode ser alterado através de mudanças na vazão da fase móvel, no tamanho de partículas da fase estacionária (que leva a mudanças nas características de escoamento da fase móvel), na viscosidade da fase móvel (e, portanto, por alterações na temperatura de operação, que afetam a viscosidade) e na espessura de filme de líquido recobrindo a superfície da fase estacionária (caso a fase estacionária seja constituída por esse conjunto fase sólida-líquido adsorvido). O efeito do aumento de N na melhoria da resolução, quando feito de forma adequada (que mantém ou altera muito pouco o tempo de retenção), pode ser visto na Figura 6. Figura 6 Efeito de mudanças em ?, k e N na resolução de dois picos adjacentes Otimização do Desempenho Variação no fator de capacidade (k) Frequentemente a separação pode ser bastante melhorada através da manipulação do fator de capacidade. Um aumento no fator de capacidade geralmente melhora a resolução, porém com aumento do tempo de análise. A Figura 7 apresenta dois gráficos mostrando as variações da resolução e do tempo de análise com o fator de capacidade, utilizando as equações (16) e (19) modificadas, apresentadas abaixo, com todos os termos que não contém kB englobados nos termos Q e Q, assumidos como se mantendo aproximadamente constantes. Pela observação da figura fica claro que valores de kB maiores de 10 devem ser evitados, uma vez que levam a ganhos muito pequenos em resolução com grandes aumentos de tempo de análise, o mesmo ocorrendo para valores de k muito pequenos, uma vez que a resolução nesses casos cai muito. O mínimo na curva do tempo ocorre para um valor de kB da ordem de 2. Dessa forma, valores adequados de kB, que proporcionam boa resolução com tempos de análise curtos se situam na faixa de 1-5. De qualquer modo, melhorias na resolução com frequência acarretam um pouco de aumento no tempo de análise.
INTRODUÇÃO AOS MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS : RS Q x [ ( kB / ( 1 + kB )] (16) tRB Qx [ ( 1 + kB )3 / ( kB )2 ] (19) Figura 7 Efeito do fator de capacidade kB na resolução e no tempo de retenção. É assumido que Q e Q permanecem aproximadamente constantes com as variações em kB. As equações são dadas acima. Normalmente, a maneira mais fácil de melhorar a resolução é através da otimização do valor de k Para fases móveis gasosas, k geralmente é alterado através do aumento da temperatura. Para fases móveis líquidas, a mudança na composição do solvente frequentemente permite manipular k de forma a conseguir melhores separações. Um exemplo desse procedimento pode ser visto na Figura 8. Figura 8 Efeito da variação do solvente em cromatogramas .
INTRODUÇÃO AOS MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS : Otimização do Desempenho Variação no fator de seletividade ( a ) Quando o valor de ? é próximo de um, a otimização dos valores de k e um aumento em N não é suficiente para se garantir uma separação satisfatória num tempo curto. Nessas circunstâncias, deve-se tentar conseguir aumentar ? mantendo o valor de k dentro da faixa ótima de 1-10. Pode-se tentar conseguir isso : (a) através de mudanças na composição da fase móvel um exemplo onde essa opção funciona é o da separação de anisol (C6H5OCH3) e benzeno (C6H6). Quando a fase móvel é uma mistura 50% água- 50% metanol, os valores de k são respectivamente 4,5 e 4,7 mas ? é igual a 1,02. Se essa fase móvel for trocada por uma mistura 37% tetra-hidrofurano 63% água, os valores de k se alteram para 3,9 e 4,7 (ainda dentro da faixa recomendada), mas ? sobe para 1,20. No primeiro caso há superposição nos picos do anisol e do benzeno, o que não ocorre no segundo caso. (b) mudando o pH da fase móvel muito interessante para separações envolvendo ácidos e/ou bases. (c) mudando a composição da fase estacionária opção normalmente menos conveniente que as anteriores, mas muito eficiente, podendo ser tentada caso o laboratório possua várias colunas diferentes à disposição para instalação no cromatógrafo. (d) mudando a temperatura da coluna isso funciona bem em cromatografia de troca iônica, mas tem pouco efeito no aumento do valor de a para cromatografia líquido-líquido e líquido-sólido. (e) partindo para o uso da incorporação de compostos especiais à fase estacionária um exemplo bem conhecido é o da separação de olefinas com o uso de uma fase estacionária sólida inorgânica impregnada com sais de prata, que leva à formação de complexos entre íons prata e compostos orgânicos insaturados. A otimização do valor de ?, levando a uma melhoria na resolução, acarreta a alteração no tempo de retenção de um dos dois compostos em análise, conforme pode ser visto na Figura 6. O Problema Geral da Eluição A Figura 9 mostra um cromatograma hipotético obtido a partir de uma mistura de seis componentes, constituída de três pares de componentes, que possuem coeficientes de distribuição bastante diferentes entre si. Na curva (a), as condições operacionais foram ajustadas de modo a que os fatores de capacidade para os compostos 1 e 2 ( k1 e k2 ) tenham valores situados na faixa ótima, entre 2 e 5. Essas condições operacionais, no entanto, fazem com que os valores de k para os outros componentes sejam muito superiores aos valores ótimos, o que leva a um tempo de retenção (e, consequentemente, um tempo de análise) extremamente elevado. Além disso, os picos correspondentes aos compostos 5 e 6 aparecem de tal forma alargados que pode ser difícil a determinação clara dos valores a eles relacionados (tempos de retenção e larguras na base ou à meia altura, por exemplo). A curva (b) mostra o que ocorreria ao cromatograma caso as condições operacionais fossem adaptadas para otimizar a resolução do par 5-6 e o tempo de ensaio : nesse caso, a resolução dos outros dois pares seria totalmente inadequada. Na curva (c) observa-se o que aconteceria caso as condições fossem otimizadas para o par 4-5 : embora nesse caso o tempo de análise fosse mais adequado que no caso (a), a resolução do primeiro par não seria adequada. Esse fenômeno exemplificado acima é extremamente comum, de forma que em condições práticas é muito difícil conseguir-se realizar uma separação de uma mistura um pouco mais complexa utilizando as mesmas condições operacionais ao longo de todo o ensaio. O procedimento mais comum é o alterar as condições operacionais ao longo da separação, de modo a otimizar a resolução passo a passo ao longo do ensaio, por exemplo alterando os valores de k continuamente. No caso do exemplo esquematizado na Figura 9, o que poderia ser feito é o seguinte : o ensaio seria iniciado nas condições de melhor resolução para o par de compostos 1-2 imediatamente depois da eluição do composto 2, as condições operacionais seriam alteradas para aquelas ótimas para o par 3-4, e, após a saída do composto 4, a separação seria completada nas condições ótimas para o par 5-6. Tal procedimento operacional, apesar de mais complexo, levaria a uma boa resolução de todos os compostos da mistura num tempo mínimo.
INTRODUÇÃO AOS MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS : A alteração de valores de k se faz normalmente através da mudança na composição da fase móvel em cromatografia líquida, e através da alteração programada de temperatura em cromatografia gasosa. Um belo exemplo das potencialidades desse último procedimento pode ser visto na Figura 10. Figura 9 Ilustração do problema geral da eluição em cromatografia ANÁLISE QUANTITATIVA A cromatografia vem apresentando crescente utilização como ferramenta analítica devido à sua simplicidade, ao custo relativamente baixo, à vasta gama de aplicações possíveis e à possibilidade de fornecer dados quantitativos confiáveis. Este último item discutirá justamente alguns aspectos gerais a respeito da obtenção de dados quantitativos, que são comuns a todas as variações dessa técnica experimental. A análise quantitativa está baseada na comparação das alturas ou das áreas dos picos correspondentes aos compostos presentes nas misturas sob análise com aqueles obtidos a partir de um ou mais padrões. Se as condições operacionais forem bem controladas, esses parâmetros (altura e área dos picos) variam linearmente com a composição.
INTRODUÇÃO AOS MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS : Figura 10 Exemplo do efeito da temperatura em cromatografia gasosa. (a) análise isotérmica a 45oC (b) análise isotérmica a 145oC (c) análise em programação de temperatura, indo de 30oC até 180oC (temperaturas indicadas no eixo em anexo). Análise baseada na altura dos picos e na área dos picos A altura de um pico é determinada entre o ponto máximo do pico e a sua base, que é determinada traçando-se uma linha que conecta a linha de base do cromatograma dos dois lados do pico, conforme indicado na Figura 3. Essa medida normalmente pode ser feita com uma boa precisão. Como já foi visto na Figura 9, tanto a altura quanto a largura dos picos (a altura dos picos é inversamente proporcional à sua largura) podem ser alteradas ao longo do cromatograma em função das condições operacionais. Dessa forma, medidas quantitativas precisas só podem ser conseguidas se as condições operacionais não levarem a alterações na forma dos picos dos compostos e dos padrões. Para evitar esse problema, pode-se fazer a análise quantitativa baseada não na altura dos picos, mas na área dos picos, que é independente de efeitos de alargamento como os exemplificados na Figura 9. Dessa forma, as áreas são medidas mais confiáveis do que as alturas, mas são determinadas com maior dificuldade que as alturas (especialmente se o cromatógrafo for antigo, e não contar com interface adequada com computador, o que ainda ocorre em muitos laboratórios pelo Brasil). Dessa forma, quando não existirem limitações devidas a alargamento de picos, medidas de altura podem ser usadas para análise quantitativa.
INTRODUÇÃO AOS MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS : Caso o equipamento possua coleta digital de dados e esteja interfaciado a um computador, normalmente a determinação da área dos picos não apresenta grandes problemas, e esse deve ser o parâmetro utilizado para análise quantitativa. Calibração e Padrões Padrões Internos A realização de análise quantitativa de forma precisa envolve a preparação de uma série de soluções- padrão com concentrações, na medida do possível, varrendo uma faixa de concentrações na mesma ordem de grandeza das concentrações existentes na amostra a ser analisada. Essas soluções-padrão são analisadas na mesma coluna que será utilizada para a análise das amostras, nas mesmas condições operacionais. As áreas dos picos correspondentes a cada concentração de solução-padrão podem, dessa forma, ser obtidas, e uma curva de calibração pode ser construída. Essa curva deve ter a forma de uma reta passando pela origem. A maior fonte de erro desse procedimento vem da incerteza no volume injetado na coluna, uma vez que frequentemente volumes muito pequenos (da ordem de µL) são utilizados, o que dificulta a reprodutibilidade mesmo com a utilização de microseringas muito precisas. Essa situação é acentuada quando amostras líquidas devem ser injetadas em sistemas de cromatografia gasosa, precisando ser vaporizados imediatamente após a injeção : nesses casos, podem ocorrer grandes variações nos volumes realmente injetados na coluna. Os erros podem ser reduzidos com o uso de válvulas automáticas de injeção, mas dificilmente pode-se alcançar imprecisões menores que 1-2%. A forma mais precisa de operação envolve o uso de padrões internos, uma vez que as imprecisões devidas ao processo de injeção serão, nesse caso, as mesmas tanto para a amostra em análise quanto para o padrão. Nesse procedimento, uma quantidade de uma substância-padrão, determinada com a precisão adequada, é injetada juntamente com a amostra a ser analisada, e a relação entre os picos dos componentes da amostra e do padrão é utilizada como parâmetro analítico. Para que esse método funcione bem, é necessário que o pico referente ao padrão apareça bem separado de todos os outros picos do cromatograma, ou seja, a sua resolução deve ser alta (RS 1,25). Com o uso de um padrão interno adequado, precisões melhores que 1% podem ser obtidas. O método de normalização de áreas Uma outra abordagem que tenta diminuir as incertezas envolvidas é o uso desse método. A eluição completa de todos os componentes da amostra é necessária, e as áreas de todos os picos é computada. A seguir, as áreas são corrigidas por meio dos fatores de resposta do detetor para cada tipo de componente (esses fatores, ou são fornecidos pelos fabricantes dos cromatógrafos, para cada tipo de detetor, ou então são determinados em laboratório), e a concentração relativa de cada composto é determinada pela relação entre a área de cada pico e a área total. O exemplo a seguir ilustra a aplicação desse método. Exemplo: Os dados a seguir foram obtidos de um cromatograma de uma mistura de álcoois butílicos (os fatores de correção do detetor foram obtidos a partir de experimentos realizados com quantidades conhecidas dos álcoois puros) Álcool Área do Pico (cm2) Fator de Resposta do Detetor Área Normalizada (cm2) n-butílico 2,74 0,603 2,74 / 0,603 4,54 i-butílico 7,61 0,530 7,61 / 0,530 14,36 s-butílico 3,19 0,667 3,19 / 0,667 4,78 t-butílico 1,66 0,681 1,66 / 0,681 2,44 Área Total 26,12 Os valores das porcentagens relativas de cada álcool na mistura seriam, portanto : % álcool n-butílico (4,54 / 26,12) x 100 17,4% % álcool i-butílico (14,36 / 26,12) x 100 55,0% % álcool s-butílico (4,78 / 26,12) x 100 18,3% % álcool t-butílico (2,44 / 26,12) x 100 9,3% 100,0% .
INTRODUÇÃO AOS MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS :
DETETORES Muitos tipos de detetores (mais de uma dezena) existem e são utilizados nas diversas modalidades de cromatografia. Foge ao objetivo deste texto uma descrição dos detetores existentes, e informações a esse respeito podem ser encontradas nas referências citadas na literatura comentada. Apenas serão mencionadas a seguir algumas características do que seria o detetor ideal: (a) Sensibilidade adequada. O que seja isso não pode ser descrito em termos quantitativos, uma vez que o que seria o adequado difere de detetor para detetor. Pode-se dizer apenas que, atualmente, os detetores atuais são capazes de detectar dentro de uma faixa de 10-8 a 10-15 g de composto analisado por segundo. (b) Boa estabilidade e reprodutibilidade. (c) Resposta linear em várias ordens de grandeza de concentração de compostos analisados. (d) Temperatura de operação podendo ir desde a temperatura ambiente até pelo menos 400oC (temperaturas elevadas são comuns em comatografia gasosa). (e) Pequeno tempo de resposta, independente da vazão da fase móvel. (f) Fácil de usar e confiável (e, na medida do possível, à prova de falhas, mesmo quando utilizado por iniciantes). (g) Similaridade de resposta a todos os compostos (fator de resposta elevado e constante ao longo de uma faixa elevada de concentrações), ou então respostas seletivas e previsíveis ao longo das diversas classes de compostos analisados. (h) Detecção não destrutiva da amostra. (i) Baixo custo. É evidente, e não é necessário enfatizar muito, nenhum detetor apresenta todas essas características.
BIBLIOGRAFIA COMENTADA Os seguintes livros foram utilizados na elaboração deste texto, e podem ser tomados como sendo um conjunto básico de referências sobre o tema, que possui uma grande variedade de livros e periódicos em vista da grande gama de aplicações e da variedade de modalidades analíticas. é Skoog, D.A. Leary, J.J. Principles of Instrumental Analyseis. 4a ed. Saunders College Publishing. Philadelphia. 1992. caps. 24-25. Livro muito interessante, contém os fundamentos de muitas técnicas analíticas. O presente texto apresenta fundamentalmente a estrutura do capítulo 24. Uma boa referência para quem deseja ter uma visão geral das técnicas de análise instrumental mais utilizadas atualmente. Apesar de ter sido editado há quase dez anos, ainda é muito atual. é Collins, C.H. Braga, G.L. Bonato, P.S. (coord.) Introdução a Métodos Cromatográficos. 4a ed. Campinas. Editora da UNICAMP. 1990. Livro interessante, contém os fundamentos de muitas modalidades da cromatografia. Uma boa referência para quem já quer começar a se aprofundar na técnica, e com a vantagem de ser em português. Apesar de ter sido editado há dez anos, ainda é atual, porém é menos detalhado que a próxima referência. Existe em bibliotecas da Poli e na do Instituto de Química. é Braithwaite, A. Smith, F.J. Chromatographic Methods. 5a ed. Chapman & Hall. Londres. 1996. Este livro é para quem já quer começar a se aprofundar nos métodos cromatográficos. Apresenta diversas das modalidades da cromatografia de forma bastante acessível, com um detalhamento suficiente para aqueles que necessitam utilizar a técnica. Recente e mais acessível que a próxima referência. Existe na biblioteca do Instituto de Química.
PMI-2201 INTRODUÇÃO AOS MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS Por: Prof. Antonio Carlos Vieira Coelho EPUSP 18 é Snyder, L.R. Kirkland, J.J. Introduction to Modern Liquid Chromatography. 2a ed. Wiley. Nova York. 1979. Este livro é para quem vai se aprofundar em cromatografia líquida. Apresenta fundamentos que são aplicáveis em diversas das modalidades da cromatografia, com um detalhamento maior do que o das referências anteriores. No fundo, apresenta os conceitos fundamentais, de uma forma mais detalhada, e por isso é bastante útil, apesar dos seus mais de vinte anos. Existe na biblioteca do Instituto de Química. Para os interessados, existe um número muito grande de referências, tanto na forma de livros, quanto na de periódicos, a respeito do tema. Os interessados podem conseguir facilmente informações a respeito consultando o Dedalus, a partir do SIBI/USP, http://www.usp.br/sibi/. Quem não souber nem o que é Dedalus, nem o que é SIBI, pergunte a uma bibliotecária de qualquer biblioteca da Poli, e ela certamente vai explicar como funciona. EXERCÍCIOS 1. Calcule o número de pratos teóricos e o número efetivo de pratos de uma coluna para um composto que apresente um tempo de retenção (tR) de 3,64 min e uma largura de pico (W) igual a 0,33min. O tempo morto (tM) é igual a 0,21 min. 2. Usando os dados apresentados na tabela abaixo (tempos de retenção corrigidos, tR), calcule os valores do fator de separação ( ? ) de cada composto em relação ao alfenol. Interprete esses resultados (em outras palavras : o que representa ? ser menor que 1, igual a 1 ou maior que 1?). Sabendo que o tempo morto é igual a 43 s, calcule os valores do fator de capacidade k para todos os compostos. Composto tR (min) amobarbital 3,53 pentobarbital 4,17 fenobarbital 5,11 alfenol 6,31 metaqualona 10,74 3. Calcule H e N para uma coluna de 25 cm de comprimento na qual um composto orgânico apresentou um tempo d retenção de 9,59 min e uma largura de pico de 1,20 min. 4. Dois compostos A e B foram analisados na mesma coluna mas em condições operacionais diferentes. Os tempo de retenção e larguras de pico observadas para as três condições são dadas na tabela abaixo. Pergunta-se: (a) as resoluções nas três condições (b) qual seria a condição operacional mais interessante? Justifique. (c) que mudanças devem ter sido feitas da condição 1 para a condição 2, sabendo que a análise é de cromatografia líquida? E se a análise tivesse sido feita em cromatografia gasosa, quais teriam sido as mudanças? Condição Operacional 1 Condição Operacional 1 Condição Operacional 1 Composto A Composto B Composto A Composto B Composto A Composto B tR 17,50 min tR 19,55 min tR 5,73 min tR 6,36 min tR 10,52 min tR 11,36 min W 130 s W 182 s W 0,56 min W 0,71 min W 0,38 min W 0,48 min PMI-2201 INTRODUÇÃO AOS MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS Por: Prof. Antonio Carlos Vieira Coelho EPUSP 19 5. As áreas relativas dos picos dos cinco compostos apresentados na Figura 8, e os respectivos fatores de resposta do detetor, são dadas abaixo. Calcule a porcentagem relativa de cada composto na mistura. Composto Área relativa dos Picos Fator de Resposta do Detetor 1 27,6 0,70 2 32,4 0,72 3 47,1 0,75 4 40,6 0,73 5 27,3 0,78 6. Determine as larguras de dois picos, um com tempo de retenção igual a 6,00 min e outro com tempo de retenção igual a 3,64 min, sendo que o valor do número de pratos teóricos (o mesmo usado para os dois picos) é igual a 1600. Explique a razão pela qual os valores de largura de picos são diferentes. É coerente usar no cálculo o mesmo valor de N para os dois compostos? 7. Os dados a seguir foram obtidos em uma cromatografia gás-líquido realizada numa coluna de 24,7cm de comprimento. Composto tempo de retenção tR, min largura da base W, min A 5,4 0,41 B 13,3 1,07 C 14,1 1,16 Sabendo-se que nas condições de operação utilizadas o tempo morto é igual a 3,1 min, pede-se: (a) o número médio de pratos efetivos e o desvio padrão desse valor médio (b) o valor da altura média de prato (c) o fator de capacidade para cada um dos três compostos (d) a resolução para os pares A/B, A/C e B/C (e) o fator de separação para os pares A/B, A/C e B/C (f) considerando o par B/C, qual seria o comprimento de coluna necessário para ser atingida uma resolução igual ao dobro da calculada em (d), considerando-se a altura média de prato aquela calculada em (b) (g) considerando o par B/C, qual seria o tempo de ensaio necessário para ser atingida uma resolução igual ao dobro da calculada em (d), sendo mantidas as mesmas condições de vazão de fase móvel.